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分光光度計(jì)在核酸的定量上也起著重要作用

發(fā)表時(shí)間:2022-07-06      點(diǎn)擊次數(shù):8012
  分光光度計(jì)是指,使單色儀或特殊光源供給的特定波長(zhǎng)的單色光通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)試樣和被分析試樣,比較兩者的光強(qiáng)度分析物質(zhì)成分的分光器。已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)儀器。
  核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率比較高的功能??梢詫?duì)可溶于緩沖液中的寡核苷酸、單鏈、雙鏈DNA和RNA進(jìn)行定量。核酸最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)為260nm。由于每個(gè)核酸的分子結(jié)構(gòu)不同,因此其換算系數(shù)不同。要對(duì)不同類(lèi)型的核酸進(jìn)行定量,需要預(yù)先選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數(shù)的換算,得到了相應(yīng)的樣品濃度。測(cè)試前,選擇正確的步驟,輸入原液和稀釋液的體積,然后測(cè)試空白液和樣品液。但是,實(shí)驗(yàn)并不順利。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者最頭痛的問(wèn)題。靈敏度越高的機(jī)器,吸光值的漂移越大。
  事實(shí)上,分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化。也就是說(shuō),儀器有一定的精度和精度。另外,還需要考慮核酸本身的化學(xué)性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH、離子濃度等。測(cè)試時(shí)離子濃度過(guò)高時(shí),讀取值有時(shí)會(huì)漂移,因此推薦使用像TE這樣pH值恒定、離子濃度低的緩沖液。
  樣品的稀釋濃度也是不可忽視的因素:因?yàn)闃悠分胁豢杀苊獾卮嬖诩?xì)小的粒子,特別是核酸樣品。這些小粒子的存在會(huì)干擾測(cè)試效果。為了將粒子對(duì)檢查結(jié)果的影響控制在最小限度,核酸的吸光值優(yōu)選至少大于0.1A,吸光值優(yōu)選為0.1-1.5A。在這個(gè)范圍內(nèi),粒子的干擾比較小,結(jié)果穩(wěn)定。因此,這意味著樣品的濃度不能過(guò)低或過(guò)高(超出光度計(jì)的測(cè)試范圍)。
  最后是操作要素。如果混合不充分,吸光值太低,會(huì)出現(xiàn)負(fù)值?;旌弦褐胁荒艽嬖跉馀?。空白液中沒(méi)有懸浮物。否則,讀數(shù)漂移會(huì)很劇烈;必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品。不這樣做的話,濃度差異太大了;換算系數(shù)和樣品濃度單位的選擇一致;窗戶(hù)磨損的彩杯不能采用;樣品的體積必須達(dá)到彩杯所要求的最小體積等,有很多操作事項(xiàng)。
  除了核酸濃度,分光光度計(jì)還同時(shí)給出了一些非常重要的比值,代表了樣品的純度。例如,A260/A280之比因?yàn)榈鞍椎奈辗鍨?80nm,所以用于評(píng)價(jià)樣品的純度。純樣本比大于1.8(DNA)或2.0)RNA)。比值小于1.8或2.0時(shí),表示有蛋白質(zhì)或酚類(lèi)的影響。A230表示樣品中存在碳水化合物、多肽、苯酚等污染物,比較純凈的核酸A260/A230之比大于2.0。檢測(cè)A320溶液的濁度和其他干擾因素。純樣品,A320一般為0。
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